各镇、有关街道畜牧兽医站：

为进一步加强动物H7N9流感防控工作，全面强化疫情排查和病原监测，及时为动物H7N9流感防控工作提供科学依据，根据常州市《关于印发<常州市动物H7N9禽流感普查检测方案>的通知》（常农发〔2013〕38号）要求，结合我区动物H7N9流感防控实际，我局组织制定了《新北区动物H7N9流感普查检测方案》，现印发给你们，请遵照执行。

附件：1. 新北区动物H7N9流感普查检测方案

2. 动物H7N9亚型流感普查检测采样信息表

3. 禽流感H7抗体检测血凝抑制（HI）试验操作规程

新北区动物H7N9流感普查检测方案

一、检测目的

掌握了解动物H7N9流感病毒在动物群体中的来源、宿主范围、传播途径和危害程度；为及时清除动物群体中的H7N9流感病原提供科学依据。

二、检测范围

全区各镇、有关街道。

三、检测对象

鸡、水禽（鸭、鹅）和人工饲养的鸽子、鹌鹑等；野生禽类；生猪。

四、检测数量

（一）活禽交易市场

对全区所有活禽交易市场进行采样。每个市场采集不少于30只家禽的对应血样、咽喉和泄殖腔拭子，尽可能覆盖多种家禽和多个摊位。

（二）家禽养殖场（村）

对30个家禽养殖场（村）进行采样，每个家禽养殖场（村）采集不少于30只家禽的对应血样、咽喉和泄殖腔拭子，尽可能覆盖多个养禽舍（户）。

一旦家禽养殖场（村）采集样品的病原学检测结果确认阳性的，对全区所有家禽养殖场（村）进行检测。

（三）生猪屠宰场

一旦出现人感染H7N9病例，对全区所有生猪屠宰场进行采样。每个屠宰场采集生猪鼻腔拭子不少于30份。

（四）其他

各镇自行确定上述场点的环境样品采样数量。

五、检测方法

（一）血清学检测

采用血凝抑制（HI）试验，检测血清中H7亚型禽流感病毒血凝素抗体。具体操作参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2003）中HI试验（见附件3）进行，HI抗体水平≥24，结果判定为阳性。

（二）病原学检测

采用农业部推荐的RT-PCR或荧光RT-PCR检测方法，检测H7亚型禽流感咽喉和泄殖腔拭子样品感病毒HA基因片段。按照推荐试剂（盒）的使用说明进行。

六、检测时间

力争2013年4月底前完成。

七、任务分工

区动物疫病预防控制中心负责组织实施全区的检测工作。各镇、有关街道负责样品的采集和送样工作，由区疫控中心负责血清学检测。

八、有关要求

（一）对阳性结果实行快报制度。区动物疫病预防控制中心血清学检测到阳性样品，送省动物疫病预防控制机构进行病原学检测，并将有关情况及时报告区农业局，区农业局在1小时内将有关情况报市农委。

（二）对采样检测情况实行日报告制度。区动物疫病预防控制中心将于每天下午5点前将当天采样检测结果汇总，报市动物疫病预防控制中心。

（三）做好样品采集记录。各镇、有关街道规范填写采样记录单（见附件2），确保记录真实、准确、可追溯。所有样品要履行登记、审核、签字、盖章制度。

（四）规范处置阳性情况。监测发现阳性的，严格按照农业部《动物H7N9禽流感应急处置指南（试行）》进行处置。

联系方式：新北区动物疫病预防控制中心，宋益，电话：85191701，传真：85191702。

禽流感H7抗体检测血凝抑制（HI）试验操作规程

一、用途

血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验可以用来鉴定禽流感病毒亚型，也可以用来判定疫苗免疫效果。

二、原理

HA和HI试验是利用某些病毒具有凝集红细胞的特性，这种特性能被特异性抗血清抑制。因而可以用已知病毒来检查血清中相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。

三、材料与试剂

1.96孔V型微量血凝板、可调微量移液器（配有滴头）、微量振荡器、普通离心机。

2.试剂

①PH7.2、0.01mol/L PBS、阿氏（Alsever’s）液、1%鸡红细胞（RBC）悬液。

②标准禽流感（H７）病毒抗原、标准禽流感（H７）阳性血清，由国家禽流感参考实验室提供。

四、操作方法和结果判定

1.血凝（HA）试验（微量法）

①在V型微量反应板的1孔—12孔均加入0.025mLPBS。

②吸取0.025mL病毒悬液（病毒抗原），加入第1孔，混匀。

③从第1孔 取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL，弃之。

④每孔再加入0.025mLPBS。

⑤每孔均加入0.025mL 1%鸡红细胞悬液（将红细胞悬液充分摇匀后加入）。

⑥振荡混匀，在室温（20℃-25℃）下静置40分钟后观察结果（如环境温度太高，可置4℃环境下）。对照红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

⑦结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。

2.血凝抑制（HI）试验（微量法）

①根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。

②在微量反应板的1孔—11孔加入0.025mL、第12孔加入0.05mL PBS。

③吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL，于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

④1—11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。

⑤每孔加入0.025mL 1%红细胞悬液，轻轻混匀，静置40min（室温约20℃，如环境温度太高，可置4℃条件下进行），对照红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

⑥结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。

五、HA和HI试验溶液的配制

1. 阿氏（Alsever’s）液配制

葡萄糖        2.05g

柠檬酸钠      0.8g

柠檬酸        0.055g

氯化钠        0.42g

加蒸馏水至100mL，散热溶解后调PH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。

2.1%鸡红细胞悬液制备

采集至少3只SPF公鸡或无禽流感或新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用PH 7.2、0.01mol/LPBS液或生理盐水洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS或生理盐水配制成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

3.PH7.2、0.01mol/LPBS的配制

①配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL。

②配制1×PBS：量取40mL25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。

③用氢氧化钠或盐酸调PH至7.2。

④灭菌或过滤。

⑤PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。